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PCR儀 - 比較和差異

什么是PCR儀

PCR儀優化樣品(pin)條件(jian)以(yi)增(zeng)(zeng)強目標核酸序列的擴增(zeng)(zeng),以(yi)進(jin)行定量(liang)和定性分析。熱循(xun)環(huan)儀設計用于執行兩(liang)種類(lei)型的聚(ju)合酶鏈(lian)式(shi)反應(ying) (PCR) 方法:終點或標準 PCR 和實(shi)時(shi) qPCR。

標準 PCR儀可擴增(zeng)目標(biao) DNA 或(huo) RNA 序列,但不包括用于實時測(ce)量擴增(zeng)速率的軟件(或(huo)檢(jian)測(ce)器(qi))。

實時 qPCR 與標準 PCR儀

實時(shi)熒光定量 PCR 系統和標(biao)準 PCR 系統有什么區別?

實時 PCR 系(xi)統定(ding)量(liang) PCR 反(fan)應進行時產生(sheng)的(de)(de)目標(biao) DNA 或 RNA 的(de)(de)拷貝數(shu),建立與反(fan)應中擴(kuo)增開始呈指數(shu)增加時的(de)(de)點(dian)相(xiang)關的(de)(de) Ct 值(或閾值循環)。因此(ci),實時 PCR 系(xi)統提(ti)供樣品的(de)(de)定(ding)性(xing)和定(ding)量(liang)檢(jian)查,而標(biao)準(zhun) PCR 系(xi)統僅提(ti)供樣品的(de)(de)定(ding)性(xing)分析(xi)。

標準(zhun) PCR 系(xi)統包括樣品(pin)塊(kuai)(與微孔板、微管或 PCR 條兼(jian)容)、加熱(re)和(he)冷卻元件(jian)以及板載控制(zhi)器(qi)。熱(re)量通過 Peltier 效應在(zai)元件(jian)和(he)樣品(pin)塊(kuai)(包含樣品(pin))之間傳遞,確(que)保快速升溫(wen)和(he)冷卻速率以及嚴格(ge)的(de)溫(wen)度(du)容差(cha)。

實(shi)時熒(ying)光定量 PCR 系統的(de)(de)功能還包括(kuo)樣品塊、加(jia)熱(re)/冷卻元件(jian)和控制(zhi)(zhi)器,以及光源(通常是鎢燈)、濾光片(pian)和光檢測器。實(shi)時 PCR儀的(de)(de)板載軟件(jian)包括(kuo)附加(jia)功能,可(ke)在(zai)反應(ying)發(fa)生時繪制(zhi)(zhi)反應(ying)結果(guo)圖表,將擴(kuo)增曲線作為 Ct 值(zhi)分配給每個陽性(xing)樣本。

聚合酶鏈式反應 - 標準與實時 PCR 反應

在將樣品裝入PCR儀之前,PCR 反應必(bi)須(xu)包(bao)含(han)多種試劑(或預混液(ye))以(yi)(yi)確(que)保目(mu)標(biao)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)成功擴增(zeng)。對于(yu)標(biao)準 PCR 反應,樣品必(bi)須(xu)包(bao)括(kuo)目(mu)標(biao)核(he)酸、無核(he)酸酶(PCR 級)水、dNTP(二核(he)苷酸三磷(lin)酸)、DNA 聚合(he)酶和設計用于(yu)結合(he)目(mu)標(biao)基因(yin)上(shang)(shang)游(you)和下游(you)的(de)定制寡核(he)苷酸序(xu)(xu)(xu)列(lie)。對于(yu)實時 PCR 反應,樣品必(bi)須(xu)包(bao)含(han)上(shang)(shang)述每種試劑,以(yi)(yi)及設計用于(yu)與(yu)目(mu)標(biao)序(xu)(xu)(xu)列(lie)退火的(de)熒光探針或報告(gao)分子。

定義的標準 PCR 協議步驟

聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術的標準方案是什么?

標(biao)準(zhun) PCR 方案包(bao)括一個初始步(bu)驟(zou),然后(hou)是一個精確的 2 步(bu)溫(wen)度序列,重(zhong)復(fu) 40 個循環。第一步(bu)或(huo)變性步(bu)驟(zou)包(bao)括將(jiang)(jiang)樣(yang)品(pin)加熱(re)至 95°C 3 分鐘,以將(jiang)(jiang)雙(shuang)鏈(lian)(lian)目標(biao) DNA 分離或(huo)變性成(cheng)單鏈(lian)(lian)。第二(er)步(bu),稱為退(tui)火步(bu)驟(zou),包(bao)括將(jiang)(jiang)樣(yang)品(pin)冷卻至 60°C,這是引物和(he) DNA 聚合(he)酶與靶序列結(jie)合(he)或(huo)退(tui)火的理想溫(wen)度。第三步(bu)或(huo)延(yan)伸(shen)步(bu)驟(zou)涉及(ji)將(jiang)(jiang)樣(yang)品(pin)加熱(re)到 72°C,以允(yun)許 DNA 聚合(he)酶使用 dNTP(或(huo)二(er)核(he)苷酸三磷酸)形成(cheng)新(xin)的 DNA 互補鏈(lian)(lian)。退(tui)火和(he)延(yan)伸(shen)步(bu)驟(zou)重(zhong)復(fu) 39 個額外(wai)的循環,以形成(cheng)數百萬個目標(biao) DNA 序列拷(kao)貝。

定義的實時 PCR 協議

實時 PCR 協(xie)(xie)議反(fan)映了標(biao)(biao)準 PCR 協(xie)(xie)議,但(dan)有一個(ge)(ge)例外:退(tui)火步驟還涉(she)及(ji)熒(ying)光(guang)探針或(huo)報告(gao)分子與目(mu)標(biao)(biao) DNA 鏈的(de)(de)結合。由于(yu) DNA 聚(ju)合酶(mei)在(zai)延伸步驟中形成新的(de)(de)互補(bu)鏈,探針會(hui)發出特定波(bo)長的(de)(de)光(guang)。當反(fan)應(ying)通過(guo) 40 個(ge)(ge)循環協(xie)(xie)議進行時,檢測器會(hui)測量光(guang),從而使研究人員可以按(an)需分析每(mei)個(ge)(ge)樣品中的(de)(de)放大率。由于(yu)實驗方案的(de)(de)不同而存在(zai)一些差異,正常(chang)的(de)(de) PCR 運行時間(jian)(jian)在(zai) 90 到 100 分鐘之間(jian)(jian)。

PCR儀的板載軟件

安裝在標(biao)(biao)準 PCR儀(yi)上的(de)(de)板載(zai)軟(ruan)件(jian)包括反(fan)應方案的(de)(de)輸出、定義(yi)當(dang)前反(fan)應步驟的(de)(de)狀(zhuang)態指示器和(he)估計的(de)(de)完成時間。更(geng)高級的(de)(de)標(biao)(biao)準熱(re)循(xun)環儀(yi)包括用戶定義(yi)的(de)(de)協議、密碼(ma)保護(hu)和(he)溫(wen)度優化向導。

標準與實時 PCR 應用

標準和實時熒光定量(liang) PCR 用于各種應用,包括(kuo)法醫學(xue)、環境科學(xue)、臨床(chuang)診斷(例如 COVID 檢(jian)測)、克(ke)隆、基因(yin)分型、突變(bian)檢(jian)測(用于癌(ai)癥篩查)和親子鑒(jian)定。

A - 放大方法

A1 - 實時 qPCR

在實時定量 PCR 中,目標序列或擴(kuo)增子(zi)在反應(ying)進(jin)行到完成(cheng)時進(jin)行測量,每個(ge)循環后進(jin)行拷貝數(shu)定量。

實時熒光定量 PCR 的優勢是什么?

實(shi)時(shi) PCR 不需要額外(wai)的(de)、冗長(chang)的(de)終點檢(jian)測步驟(zou),例如(ru)凝膠電(dian)泳,但(dan)為研(yan)究人員(yuan)提(ti)供了(le)比(bi)傳(chuan)統 PCR 更(geng)少的(de)步驟(zou)的(de)定(ding)量和定(ding)性樣品分析。該(gai)過程(cheng)比(bi)標準 PCR 成(cheng)本更(geng)高(gao),但(dan)該(gai)協議不那么費力(li),提(ti)供按需分析(用于時(shi)間敏(min)感的(de)研(yan)究),并且不易(yi)發生(sheng)交叉污染。

A2 - 標準終點 PCR

在標準 PCR 或常規終點 PCR 中(zhong),使用終點分析檢測(ce) DNA 靶序列(lie)或擴增子,通(tong)常通(tong)過(guo)凝膠電泳(yong)完成(cheng)。常規 PCR 提供樣品的定性分析,但不提供定量評(ping)估(gu)。該(gai)(gai)過(guo)程比實時 PCR 成(cheng)本(ben)更低,但該(gai)(gai)協議更長、更費力并且更容易受(shou)到樣品交叉污(wu)染的影響。

B - PCR儀板容量

PCR儀包(bao)括與不(bu)同(tong)數量(liang)的(de)微管、PCR 條和(he)微孔(kong)板兼容(rong)(rong)的(de)板塊。Biometra 的(de) TAdvance 熱循環儀具有快速更換、可(ke)互換的(de)板塊,與 96 孔(kong)和(he) 384 孔(kong)微孔(kong)板、0.5 ml 微管和(he) 0.2 ml PCR 條兼容(rong)(rong)。Biometra 的(de) TRIO PCR儀具有三個(ge)(ge)不(bu)同(tong)的(de)板塊,允(yun)許用(yong)戶靈活地(di)并行(xing)運行(xing)三個(ge)(ge)獨立的(de) PCR 協議。Biometra TRIO 上的(de)每個(ge)(ge)板塊最多可(ke)容(rong)(rong)納 48 個(ge)(ge)樣品。